Selon l'agence de presse néerlandaise ANP, le non l'emporte avec 61,1%, et le taux de participation s'élève finalement à 32,2%. Des estimations initiales le plaçaient sous les 30%, ce qui l'aurait invalidé.
Les résultats définitifs seront publiés mardi par la commission électorale mais si le référendum est bel et bien validé, "l'accord ne peut être ratifié tel qu'il est actuellement", a affirmé M. Rutte.
Les partis politiques, dont ceux qui avaient mené campagne en faveur du oui, ont secondé cette déclaration et rejeté une ratification de l'accord, qui vise à renforcer le dialogue politique ainsi que les échanges économiques et commerciaux entre l'UE et l'Ukraine.
Selon la loi sur le référendum, le texte doit être représenté au Parlement et au Sénat.
Les résultats de ce référendum, dont les organisateurs admettent qu'il ne concerne pas l'Ukraine mais répond à une animosité plus large envers l'UE, seront examinés à la loupe en Grande-Bretagne, quelques mois avant un vote en juin sur une sortie de l'Union européenne, le "Brexit".
"Ce rejet humiliant de l'accord avec l'Ukraine prouve que les gens n'ont pas besoin de supporter l'Union européenne pour se sentir européens", a affirmé dans un communiqué Brian Monteith, le porte-parole de la campagne en faveur du Brexit.
Les Pays-Bas sont le dernier pays de l'UE à ne pas avoir ratifié l'accord, qui a cependant reçu le feu vert du Parlement. Le vote n'est pas contraignant mais une victoire du non peut "ouvrir la voie à une crise européenne", avait prévenu le président de la Commission européenne, Jean-Claude Juncker, indique l'AFP.